Estructura cel·lular dels cianobacteris Català a. Membrana exterior b. Capa de peptidoglicà c. Membrana plasmàtica d. Citoplasma e. Grànul de cianoficina f. Ribosoma g. Grànul de glicogen h. Cos lipídic i. Carboxisoma j. Ficobilisoma k. Grànul de polifosfat l. Vacúol gasífer m. Tilacoide n. Nucleoplasma (Photo credit: Wikipedia)

Las cianobacterias, también conocidas como algas verde-azuladas, son microorganismos  procariotas, aeróbicos y fotoautótrofos, en otras palabras, no tienen núcleo diferenciado,  necesitan del oxígeno diatómico para vivir o poder desarrollarse y efectúan  fotosíntesis para obtener energía. Crecen, principalmente, en medios de agua  dulce y marino, donde la creciente eutrofización (enriquecimiento de  nutrientes, principalmente nitrógeno y fósforo) favorece su proliferación incontrolada  (afloramientos), especialmente en los meses de verano, con el consiguiente impacto  negativo sobre la calidad de las aguas.

Por otro lado, a este  problema medioambiental se suma el hecho de que algunas cianobacterias producen  ciertos metabolitos secundarios, conocidos como cianotoxinas, que resultan tóxicos para distintos organismos -incluídos  los seres humanos- lo cual supone un importante riesgo sanitario.

Las microcistinas (MCs) son las toxinas más frecuentes en las  proliferaciones de cianobacterias en aguas continentales. Se trata de heptapéptidos  cíclicos, muy estables, producidos por varios géneros de cianobacterias, como Microcystis, Anabaena y Oscillatoria. La  exposición a dosis altas de MCs puede  conducir a la muerte por choque hipovolémico, también llamado hemorrágico, mientras  que la exposición crónica a dosis bajas parece estar relacionada con la  aparición de cáncer de hígado.

Estas toxinas son resistentes a los oxidantes empleados  habitualmente en el tratamiento de aguas, por ejemplo a la cloración, y su  degradación térmica se produce a temperaturas superiores a 120 ºC,  lo cual dificulta su eliminación por ebullición del agua. La Organización Mundial  de la Salud (OMS)  ha establecido un valor provisional de concentración máxima en agua de  microcistina-LR (MC-LR), una de las más abundantes en nuestro país, de 1 mg/L para el consumo directo. Por todo  ello, es necesario disponer de métodos de detección sensibles, rápidos y  selectivos que faciliten el control de la presencia de MCs en el medioambiente y  que permitan asegurar la calidad del agua que llega al consumidor.

El Grupo GSOLFA de la UCM ha desarrollado un biosensor óptico, basado en  micromatrices (“microarrays”) de anticuerpos, para la determinación de MCs en agua  dulce. El análisis está basado en un inmunoensayo de tipo competitivo. En este caso, la cianotoxina presente en la muestra compite con un derivado  de la misma, inmovilizado sobre una superficie plana que  actúa como guía de onda de la radiación (chip), por los sitios de unión  de un anticuerpo selectivo a MC-LR.

La cantidad de anticuerpo unido a la  superficie del chip se evalúa, posteriormente, empleando un anticuerpo  secundario marcado con un indicador o sonda fluorescente, que interacciona  selectivamente con el anticuerpo fijado a la superficie sensora, obteniéndose  una señal inversamente proporcional a la concentración de MC-LR presente en la  muestra analizada.

El microarray desarrollado emplea una  guía de onda plana, con una superficie capaz de acomodar múltiples regiones  sensibles (matriz 15 x 6) del orden de µm² a mm², lo que facilita la detección simultánea de múltiples  analitos, o bien, como en este caso, del mismo analito, en múltiples muestras.

Para esta aplicación concreta se ha  empleado como guía de onda plana un vidrio portaobjetos de microscopio y, en zonas  concretas del mismo (15 canales paralelos entre sí), se ha inmovilizado un  derivado de la MC-LR  (Figura 3), un control positivo y uno negativo, empleando  micromoldes de silicona (PDMS). El chip funcionalizado  puede utilizarse de forma inmediata, o almacenarse durante semanas antes de su  empleo para la realización de análisis “in situ”.

La detección de las MCs se lleva a  cabo empleando un instrumento que integra, en una unidad portátil (Leopard  Array BiosensorTM HAB-2002, Hanson Technologies, Inc., EEUU), los sistemas de  excitación (diodo láser), detección (cámara CCD) y microfluídico. En este  instrumento, la radiación procedente del diodo láser incide sobre uno de los  bordes del vidrio, empleado como guía de onda, e ilumina, de forma homogénea,  la zona sensible en la que se produce la reacción inmunológica. La radiación se  transmite por reflexión total interna originando un campo electromagnético,  denominado campo evanescente, que penetra una cierta distancia desde la  superficie excitando a las moléculas fluorescentes que se encuentran en la zona  sensible. La radiación emitida se mide con una cámara CCD que permite obtener  una imagen de la superficie de la guía de onda.

El proceso de medida es muy simple, el chip funcionalizado se inserta en el equipo de medida haciéndose  fluir sobre su superficie las muestras de agua a analizar (hasta 6 muestras), a  las que se ha adicionado una concentración constante y conocida del anticuerpo  selectivo a MC-LR. Tras la incubación con un trazador fluorescente, se  adquiere una imagen de la superficie; la intensidad de la señal fluorescente (Figura  3), previa calibración, nos permite calcular la concentración de microcistina  en la muestra.

El biosensor optimizado  presenta un límite de  detección de 16 ± 3 ng L^-1 y un intervalo dinámico de 0.06 -1.5 µg L^-1, que incluye el valor  guía recomendado por la OMS.   El microarray presenta reactividad cruzada frente a otras  MCs, como microcistina RR (MC-RR 90%) y microcistina YR (MC-YR 91%), que también  aparecen en aguas contaminadas en España. El dispositivo puede realizar seis  determinaciones simultáneas en 60 min y los chips se pueden reutilizar para  varios ensayos sin una pérdida significativa de sus prestaciones analíticas,  algo novedoso frente a otros resultados descritos en bibliografía empleando microarrays.

El microarray se ha aplicado al  análisis de distintas muestras de aguas de lagos y ríos de la geografía  española, en colaboración con el Centro de Estudios Hidrográficos del CEDEX (CEH-CEDEX) y los resultados se han validado mediante la técnica de HPLC-MS-MS.

Continuando con esta línea de  investigación, el grupo GSOLFA trabaja actualmente en el desarrollo de microarrays  de anticuerpos para el análisis simultáneo e “in situ” de contaminantes  medioambientales emergentes empleando un único chip (análisis multianalito) de  forma rápida, sencilla y a bajo coste. Para ello se están desarrollando nuevos  elementos de reconocimiento biomimético (enzimas modificadas con dextranos,  polímeros de impronta molecular…) que pueden resultar de gran utilidad para la  fabricación, en un futuro cercano, de microarrays multianalito.